【9.4.1.2】高温体外转录合成低免疫原性RNA
用于体外合成这些的技术——主要使用噬菌体 RNA 聚合酶 (RNAP) 的转录 RNA 已得到广泛认可。然而，已知用 RNAP 合成的转录物在体内表现出通常不受欢迎的免疫刺激活性。以前的研究已经确定双链 RNA (dsRNA) 是体外转录 (IVT) 过程的主要副产品，作为细胞免疫反应的触发因素
免疫反应的另一个主要刺激物来自 IVT 反应中存在的污染物。IVT 反应中鉴定的主要副产物是双链 RNA (dsRNA)。这可能源于 T7 RNAP 的 RNA 依赖性 RNAP 活性。使用 T7 RNAP 合成的转录本的引入已被证明可激活细胞溶质传感器，例如 RIG-I 和 MDA5，这些传感器可激活先天免疫系统以响应病毒 dsRNA。最近的研究已经确定了 IVT 反应中导致 dsRNA 分子形成的两种主要类型的副产物。
- 第一个是由径流产物（run-off products）的 3'-延伸形成，该序列与径流转录本体内的互补序列以顺式（通过在同一 RNA 分子上折叠）或反式（与第二个 RNA 分子退火）退火) 形成延伸的双链体。
- 第二种类型的 dsRNA 分子是由反义 RNA 分子与径流转录物杂交形成的。据报道，反义 RNA 分子以独立于启动子和径流转录本的方式形成 ( Mu et al. 2018 )。这些副产物形成的机理和结构要求尚不清楚，因此，设计方法来防止它们的形成或使它们能够去除是一个挑战。
我们描述了热稳定 T7 RNAP 的使用以及 IVT 反应温度对 dsRNA 副产物形成的影响。我们对 IVT 反应中的 dsRNA 产物进行了表征，并表明高温转录会导致 3' 延伸 RNA 的减少，但不会导致反义 RNA 副产物的减少。
为了检测 dsRNA 副产物，我们使用了标准免疫印迹分析，该分析涉及通过对 dsRNA 特异的单克隆抗体 (J2) 识别连续双链结构（长度 > 40 bp）
最近已经提出了几种不同的方法来克服体内 dsRNA 副产物的影响。
- 去除双链副产物的常用方法是在合成反应完成后使用基于色谱的纯化步骤（Karikó 等人 2011；Weissman 等人 2013）。然而，根据 dsRNA 副产物的性质实施这种纯化方法，可能无法去除所有污染物。有人建议选择性结合纤维素 ( Baiersdörfer et al. 2019)，但尚不清楚这种方法是否可以区分 RNA 内在二级结构的影响。
- 将 DNA 寡核苷酸退火到 RNA 的 3' 末端可以帮助克服一些 dsRNA 副产物的产生（Gholamalipour 等人，2019 年）；然而，对于治疗应用，这种策略需要特异性去除 DNA 寡核苷酸。
- 最后，已建议降低 IVT 反应中的镁离子水平以降低 dsRNA 副产物的水平 ( Mu et al. 2018)，但它也会影响反应的总产率。此外，尚不清楚上述方法是否适用于减少/去除反应中可能产生的两种 dsRNA 副产物。
我们对热稳定 RNAP 的表征（图 2 A、B、7）表明，用热稳定 RNAP 合成的 RNA 在体内是有功能的，并且由于 3' 延伸副产物的减少，树突状细胞中的免疫反应降低。此外，模板编码的 poly(A) 加尾和高温 IVT 的组合减少了两种 dsRNA 副产物的形成，提高了 RNA 的纯度，并可能减轻对大量合成后纯化的需求。
参考资料
- Synthesis of low immunogenicity RNA with high-temperature in vitro transcription。 https://rnajournal.cshlp.org/content/26/3/345.full
