【8.3.4.2】工程化circRNA
为了最大限度地提高 circRNA 翻译，我们优化了五个要素：
- 载体拓扑结构、
- 5’非翻译区
- 3' 非翻译区
- 内部核糖体进入位点
- 招募翻译起始机制的合成适体。
总之，这些设计原则将 circRNA 蛋白产量提高了数百倍，在体外提供了比信使 RNA 更高的翻译，在体内提供更持久的翻译，并且可在多种转基因中推广。
二、结论
2.1 m6A 掺入不会对 circRNA 翻译产生不利影响
与未修饰的 circRNA 相比，含有 5% m6A 的 circRNA在体外转染或电穿孔后显示出等效的翻译
这些结果表明 5% m 6 A 掺入不会对 circRNA 翻译产生不利影响，并且可能会提高稳定性。
鉴于它们的免疫原性降低，我们将随后的优化工作集中在 m6A 修饰的 circRNA 上。展望未来，除非另有说明，否则我们在每个 circRNA 制剂中加入 5% m6A。
2.2 circRNA 翻译的载体拓扑和间隔要求
测试这些 circRNA 的表达表明，增加间隔长度对翻译无益，并且核糖体不受 td 剪接疤痕二级结构的影响。
- 我们发现间隔子长度为 50 个核苷酸 (nt) 的 circRNA 产生最强的翻译（图2a）
- 我们还测试了编码序列后终止密码子的数量是否会影响 circRNA 的表达，我们发现添加两个以上的终止密码子（在我们的克隆平台中使用的数量）会降低翻译强度而不影响编码蛋白质的大小（图 1）
2.3 5' 和 3' UTR 可以改善 circRNA 翻译
我们测试了两个具有明确效果的高度结构化序列：xrRNA，一种在石竹病毒中发现的 RNA 发夹，可阻止 5'-to-3' 外切核酸酶 Xrn1 的降解（参考文献20）和 Apt-eIF4G，一种 eIF4G-当添加到转录本的 5’UTR 时，招募已显示可增加 mRNA 翻译的适体21 . 在将这些序列整合到 circRNA 的 5’UTR 并检测 NanoLuc 表达后，我们发现 PABP 基序和 eIF4G 招募适体对翻译的改善最大
。然而，用短或全长形式替换 3' 间隔HBA1 3' UTR 显着提高了翻译强度（图2d）。
2.4 完整的病毒 IRES 对于强翻译至关重要
- 总之，这些数据表明全长 IRES 是强 circRNA 翻译所必需的。
- 在计算机上减少 IRES 的 3' 端和编码序列的 5' 端之间的碱基配对相互作用可以为 circRNA 翻译带来额外的好处。
2.5 eIF4G 与 iCVB3 结合的中断消除了翻译
-
LNA #3 剂量依赖性地破坏 NanoLuc 活性，暗示 iCVB3 域 V 中的 eIF4G 位点是翻译 circRNA 所必需的。出乎意料的是，我们还发现用 LNA #1 锁定结构域 I-II 连接点的二级结构以剂量依赖性方式改善了翻译
-
synIRES06 和 synIRES08，其中 Apt-eIF4G 分别插入域 IV 的远端和近端环，显示出比野生型 iCVB3 显着改善的翻译
2.6 识别稳健的高强度 IRES
- 在我们的筛选中，我们在多个细胞系中发现了许多具有比 iCVB3 更强翻译的 IRES（图5a）。特别是来自人类鼻病毒 B (HRV-B) 和肠道病毒 B (EV-B) 物种的 IRES，如 iHRV-B3 和 iEV-B107
- 从这 93 个改组的 IRES 中，我们确定了 9 个具有比野生型 iHRV-B3 显着更强的翻译活性，说明了 IRES 改组为 circRNA 应用设计改进的 IRES 的能力
- 。我们专注于这个十字形结构内的环，并在远端、顶端和近端环位置进行 Apt-eIF4G 插入，通过合理插入碱基配对的 RNA 核苷酸并在计算机上验证结构来改变所得茎的长度
2.7 组合 circRNA 优化的量化
- 我们从 NanoLuc 下游的 iCVB3 开始，并连续合并 m 6 A，反转向量拓扑，添加随机 5' 和 3' UTR 间隔，修改 5' 间隔以包含 PABP 基序，用HBA1 3替换 3' UTR 间隔' UTR，将 IRES 切换到 iHRV-B3，并将近端环适体插入 iHRV-B3。我们发现这些变化在不影响 RNA 产量或环化效率的情况下逐渐增加了 circRNA 表达（补充图8a、b），最终设计相对于未优化的 circRNA 提高了 224 倍，并且比 CleanCap 和 100% N 的翻译明显更多1个Ψ修饰的mRNA。
- 总之，我们的数据表明，工程化的 circRNA 可以在体内以与修饰的 mRNA 相似的强度表达，但持续时间更长。
参考资料
- Engineering circular RNA for enhanced protein production。 https://www.nature.com/articles/s41587-022-01393-0
