【8.4.3】XTEN综述
XTEN™是一类非结构化的亲水性，可生物降解的蛋白质聚合物，旨在延长治疗性肽和蛋白质的半衰期。 XTEN聚合物和XTEN融合蛋白通常在大肠杆菌中表达，并通过常规蛋白质色谱法纯化为具有确切长度和序列的单分散多肽。未结构化的XTEN多肽的流体力学体积比类似质量的典型球状蛋白大得多，因此赋予附着在其上的治疗有效载荷以堆积效应。自从其发明以来，XTEN多肽已被用于延长各种基于肽和蛋白质的治疗剂的半衰期。正在进行多项临床和临床前研究以及相关的药物发现和开发工作。这篇评论详述了XTEN和XTENylated分子的理化性质和生物学行为的最新了解。此外，重点介绍了几种先进的药物发现和开发工作的发展路径和状态
一、前言
在过去的30年中，生物制药行业开发了许多基于生理活性肽和蛋白质的药物，例如激素，酶，细胞因子，抗体和抗体片段以及生长和凝血因子。作为生理途径的天然成分，生物疗法倾向于高度选择性，有效和安全。将许多治疗性肽和蛋白质作为替代疗法给予具有临床缺陷表现的患者，例如糖尿病，血友病和生长激素缺乏症（GHD）。但是，生物制剂有一些局限性。
- 首先，除了极少数例外，它们不能口服，但必须通过注射给药。
- 其次，肽和大多数蛋白质在循环中的特征是半衰期短，并且通常在数小时内（即使不是数分钟）即可从体内清除，因此在治疗过程中需要频繁注射。因此，为了促进对新蛋白质疗法的接受并改善患者的依从性，已大力致力于开发各种半衰期延长技术。
延长治疗性蛋白半衰期的策略是多种多样的，大多数方法将药物与庞大的部分连接起来，或者启用FcRn介导的回收利用。膨胀疗法（Bulking approaches）旨在通过增加生物活性分子的流体动力学体积来减慢肾脏清除率。另外，主体部分可保护分子免受蛋白水解降解和宿主免疫系统的检测，并减少清除受体结合。聚乙二醇（PEG）历史上是第一种通常用于提高生物治疗剂的体内半衰期的填充剂，现已被纳入多种获准的产品中（见[1-4]）。然而，开发聚乙二醇化药物的成功伴随着越来越多的关注。
- PEG不可生物降解，在动物研究中已观察到聚乙二醇化化合物的细胞空泡[5-7]。
- 尽管人们普遍认为PEG本身不是免疫原性的，但据报道PEG化治疗剂的免疫原性似乎取决于有效载荷，PEG大小和化学组成。
- 在用PEG化蛋白治疗的患者中检测到的抗PEG抗体的特异性和中和特性仍有争议[8-10]。在健康人群中也有抗PEG抗体的报道。并且假设是由于暴露于化妆品，药品和加工食品中的PEG和含PEG的化合物引起的[11-13]。该人群中抗PEG抗体表达的生物学影响尚不清楚。
PEG的成功和局限性都刺激了替代性可生物降解填充剂的开发，例如天然和半合成多糖，包括O和N连接的寡糖，葡聚糖，羟乙基淀粉（HES），聚唾液酸和透明质酸[14， 15]，以及非结构化蛋白质聚合物，例如高氨基酸聚合物（homo-amino acid polymers,），弹性蛋白样多肽（elastin-like polypeptides），XTEN和PAS [14,16]。
第二种半衰期延长方法利用了通过FcRn受体的再循环（在[14,17,18]中进行了综述）。两种血浆蛋白，血清白蛋白和IgG，在循环中具有极长的半衰期。当细胞通过非特异性内吞作用被摄取时，两种蛋白质都结合至酸性内体中的FcRn受体，并受到保护，免受细胞内降解。蛋白质-受体复合物循环到细胞表面，在血浆中性pH下白蛋白和免疫球蛋白分子被释放回循环中。已经使用了几种方法来利用IgG或白蛋白的半衰期延长，以用于治疗有效载荷：（1）将有效载荷与IgG的Fc结构域或白蛋白多肽遗传融合； （2）有效载荷与白蛋白，IgG或Fc结构域的化学缀合； （3）与物理结合IgG或白蛋白的介体分子融合或缀合。这种介体的例子是IgG结合肽，脂肪酸，白蛋白结合肽和白蛋白特异性抗体片段[14,16]。
这篇综述的重点是XTEN，这是由Amunix开发的一类非结构化的可生物降解的蛋白质聚合物，旨在增加与基因融合或化学偶联的治疗性肽和蛋白质的半衰期。 XTEN聚合物被认为是由六种亲水，化学稳定的氨基酸A，E，G，P，S和T组成的非免疫原性多肽。为了创建遗传和化学稳定的多肽，它们缺乏二级结构并且在大肠杆菌中高度表达，产生了一个非重复的36个氨基酸长的片段文库，并针对表达和生物物理特性筛选了近1500个独特的片段。迭代连接选择的区段，并重新筛选得到的分子以获得最大表达，从而产生一系列864个残基长的多肽。测试了这些多肽中五个最高表达的基因稳定性，在水性介质中的溶解度，热稳定性和聚集倾向。选择过程中出现的是命名为XTEN的多肽[19]。原型分子之后是基于亲本XTEN分子的多种衍生物的开发和表征，如今，XTEN的名称适用于整个多肽组。 XTEN蛋白聚合物的理化和生物学特性，其可制造性和特定应用将在下面讨论。
二、XTEN蛋白聚合物 XTEN protein polymers
2.1 XTEN蛋白聚合物的理化性质和分析
2009年描述了由A，G，E，P，S和T组成的第一个864个氨基酸残基XTEN（XTEN864）多肽[19]。所选择的序列形成了XTEN所显示的理化特性的基础，包括缺乏二级结构，非常高的溶解度和较低的聚集倾向。在随后的几年中，探索了代表亲本864个氨基酸长的分子片段的较短的XTEN多肽[20,21]。尽管理论上标准的克隆技术可以允许将任意数量的氨基酸残基掺入XTEN多肽中，以帮助进行实用和系统的评估，但仍生产了其他XTEN聚合物并以确定的分馏大小进行了表征，包括864的2/3（576个残基），1/2（432个残基），1/3（288个残基）和1/6（144个残基）。本节介绍适用于XTEN蛋白质聚合物的常见蛋白质分析方法，并重点介绍XTEN与常规球状蛋白质和非蛋白质聚合物之间的主要区别。我们用来表征XTEN的分析方法包括尺寸排阻色谱（SEC），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电喷雾电离质谱（ESI-MS），反相高效液相色谱（RP） -HPLC），疏水相互作用色谱（HIC），阴离子交换色谱（AEX），动态光散射（DLS）和粘度测定
尺寸排阻色谱法（SEC,Size-exclusion chromatography）是一种广泛使用的技术，用于表征高分子聚合物和蛋白质等大分子[22,23]。大分子通过SEC基于其流体动力学体积进行分离，进而与计算出的球状分子量（MW）相关蛋白质。对于缺乏二级结构的XTEN多肽，观察到异常大的流体动力学体积[19,20]。为了进一步探索该特性，将长度在144至1728个氨基酸残基范围内的XTEN聚合物进行混合，并使用具有500孔径孔径珠的尺寸排阻色谱柱进行分析。为了进行比较，平行分析了球蛋白的标准混合物（图1，A，B）。作为一个整体，XTEN聚合物的特征在于比球形蛋白更早地洗脱，尽管它们的分子量明显小得多。例如，53 kDa XTEN576的洗脱时间与670 kDa甲状腺球蛋白的洗脱时间基本相同，而79 kDa XTEN864的洗脱时间与1.5 MDa球蛋白相当。 XTEN聚合物的洗脱时间与MW值的对数成反比。值得注意的是，在该组中，XTEN聚合物与球状蛋白的偏离明显小于回归线。因此，无论长度如何，所有XTEN聚合物均表现为同质的无规卷曲聚合物。 XTEN的此属性对于以可预测的方式调整治疗有效载荷的伤害动力学特性至关重要。 同样，该性质表明，施用XTENylated药物后XTEN生物降解不会导致药物功能突然丧失，而是会导致药物半衰期逐渐缩短。 XTEN长度与半衰期之间的关系在3.1节中讨论。尽管SEC对XTEN的大小敏感，因此可用于表征蛋白质制品中的聚集体，但向XTEN864添加融合蛋白或肽有效载荷的结合对其洗脱谱图没有显着影响[24]。
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这些分析技术共同突出了XTEN的特性，使其成为治疗性肽和蛋白质半衰期延长的有用填充剂。 它们还可以用作XTEN酰化融合产物或XTEN缀合的有效载荷特性的预测工具，以确保此类分子具有所需的理化和临床特性，例如循环中的半衰期长，高溶解度和易于制造
参考资料
- Podust, V. N., … Schellenberger, V. (2016). Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers. Journal of Controlled Release, 240, 52–66.
