【5.8.3】热力学测量

在研究蛋白质结构和功能时，必须测量各种物理量，包括：

• 热稳定性和化学稳定性 thermal and chemical stability
• 与配体的结合亲和力 binding affinity to a ligand
• 溶解度 solubility
• 动态性和灵活性 dynamics and flexibility
• 反应 reactivity

人们想仅从结构中预测热力学性质

当两个相互作用的分子在水中聚集在一起时：

• 溶剂分子从结合表面释放出来 solvent molecules are released from the binding surface
• 溶质分子形成键（氢键、范德华接触等）
• 例如，预测所有焓和熵变化并将其制成表格

一、稳定性

常见的蛋白质工程目标之一是稳定蛋白质，同时保持其功能

• 稳定性的提高意味着保质期更长，避免了特殊处理，例如：冷藏或自然干燥，使传播蛋白质药物的便宜而有效成为可能
• 易于维护和处理（无冻干的人类生长激素使用前需要复溶）
• 可能需要化学修饰或定点诱变

高溶解度和抗降解性（蛋白水解）很重要

结构完整性可以通过光谱（CD、荧光），流体动力学和色谱法 进行监测

二、热稳定性和化学稳定性 Thermal and chemical stability

在蛋白质工程过程中通常使用热/化学稳定性的测量，用于监测突变影响和设计质量

注意：核心定义不清的蛋白质可能具有极高的稳定性

Bryson et al, Protein Sci 7, 1404 (1998)

二、化学变性

添加变性试剂，如尿素和盐酸胍 （GdnHCl） 可以改变折叠状态和未折叠状态之间的平衡

两者都破坏了蛋白质内的氢键网络以及蛋白质-溶剂的相互作用，从而破坏了折叠结构的稳定性

• 变性机制尚不完全清楚
• 参见 Bennion and Daggett， PNAS 100， 5142 （2003）

部分由于其净电荷，GdnHCl在诱导蛋白质变性方面的效率约为尿素的两倍（即在大约一半的浓度下展开蛋白质）

三、色氨酸荧光

荧光是在波长 λa 处吸收光并随后在波长 λe 处发射光

色氨酸荧光（λa~278和λe~348 nm）用于研究蛋白质构象（即三级结构）

荧光的精确λ和强度在很大程度上取决于吲哚周围的局部环境

http://www.molecularexpressions.com

在所有三个区域都需要足够的数据点：

• 前、后和过渡需

要确保达到平衡

• 可能需要很长时间（>小时）
• 过渡过程中最慢
• 反转实验方向应产生相同的曲线

四、热变性

4.1 差示扫描量热法（DSC）

DSC可以通过计算将温度升高固定量所需的热量来测量样品的热容：

Cp= △Q/△G

当蛋白质变性时，其热容增加，导致Cp发生正变化

或者，如果没有量热计，可以估计∆Cp

Cp ≈ 172 + 17.6N -164*（# of SS）

五、结合亲和力

六、Surface plasmon resonance (Biacore)

参考资料

• https://www.acsu.buffalo.edu/~sjpark6/pednotes/Thermodynamic%20Measurements.pdf