【5.1.1.1】电泳(IFE/SDS PAGE/)
电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然，带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。在待分离样品中，各种生物分子的带电性质以及大小、形状等存在的差异使得它们的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对它们进行分离、鉴定或纯化。与蛋白质分离纯化有关的电泳技术有：等电聚焦（isoelectric focusing electrophoresis，IFE）电泳、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）。
1. IFE
IFE需要在凝胶中加入两性电解质，以便在两极之间建立pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下发生迁移，最后各自移动到并聚焦于凝胶上某一特定的位置，各个位置的pH与聚焦在此的蛋白质的pI相同。通过IFE，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，还可以直接测定出各种蛋白质的pI。
2. SDS-PAGE
蛋白质在非变性聚丙烯酰胺凝胶（native PAGE）中电泳时，其迁移率取决于分子的大小、形状及其所带净电荷等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，并使分子形状趋于一致，那电泳迁移率将只取决于分子的大小。在此基础上，还可以测定出蛋白质的相对分子质量。阴离子去污剂SDS具有这种作用。在向蛋白质溶液中加入足够量的SDS以后，SDS即与蛋白质形成复合物。SDS带负电，能使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其总量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。SDS还能打破维持蛋白质三级结构的次级键，使各种蛋白质都呈线状展开。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，仅取决于它们的大小，因而SDS-PAGE可以用于测定蛋白质的相对分子质量。 SDS-PAGE不仅可以用来测定蛋白质的大小，还可以用来鉴定蛋白质的纯度、定量蛋白质和二硫键的确定等。
蛋白电泳的迁移率与一下三个因素有关：
- 形状—所有的蛋白质在用还原剂处理后都处于一级结构中。 因此，形状不影响蛋白质的分离。
- 电荷—经过SDS处理后，所有的蛋白质都是负电荷， 因此，电荷不影响分离。
- 大小—蛋白质的分离完全与它们的分子量大小有关。
在电泳中，分子量越小的多肽移动得越快，因为它们遇到的阻力更小。分子量越大的多肽移动得更慢，因为它们遇到的阻力更大。因此蛋白质完全是因为分子量大小的不同而分开
ＳＤＳ主要的作用有：
- 去蛋白质电荷
- 解离蛋白质之间的氢键
- 取消蛋白分子内的疏水作用
- 去多肽折叠。所以不能断开二硫键。
ＤＴＴ：还原剂，可以断开二硫键。有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体，如果加入β－巯基乙醇，它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，电泳的样品将会被完全还原成单体形式，不加的样品中则会保持聚体的形式，这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。
SDS-PAGE有两种：
- 非还原性（non-reduced）SDS-PAGE
- 还原性（reduced）SDS-PAGE之分
均是变性条件下的电泳。还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂（如DTT或2-巯基乙醇等）。非变性（non-denaturing）PAGE又称为天然（native）PAGE，操作的基本过程与SDS-PAGE相似，唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性，包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂（如SDS）、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。
蛋白的样品处理方法有3种：
- 还原SDS处理
- 带有烷基化作用的SDS处理
- 非还原SDS处理
还原SDS处理：是常规的SDS—PAGE，在上样缓冲液中加入还原剂，DTT等，打开二硫键，SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。
带有烷基化作用的SDS处理：烷基可以永久并且牢固的保护巯基，维持单体形成，防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。
非还原SDS处理：样品中只加入ＳＤＳ，而不加ＤＴＴ还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠。保持这一定的４级结构。非还原ＳＤＳ处理因为二硫键的连接，可能会有几条多肽链连在一起，所以最后的分子量要比预期的大，可能是２倍或３倍。
3. 双向电泳
双向电泳也称二维电泳或2D电泳，它由第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳组成，第一向利用等电聚焦的方法使pI不同的蛋白得到分离。将第一向电泳的凝胶转移到SDS-PAGE平板的顶部，即进行第二向电泳，这一次是按照分子大小来分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。在对凝胶进行染色以后，可以观察到各个蛋白质的位置。 使用双向电泳，研究者有可能观测并建立一种特定细胞所表达的全部蛋白质的目录。ExPASy（http://expasy.hcuge.ch/）已建立了双向电泳数据库，数据库内含有多种类型的细胞和组织的蛋白质双向电泳图谱。
参考资料
