【5.2】实验--免疫器官的观察和免疫细胞的分离

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统。免疫系统由免疫 器官和组织、免疫细胞及免疫分子组成。免疫器官包括中枢免疫器官(骨髓和胸 腺) 和外周免疫器官(脾脏、淋巴结及黏膜相关淋巴组织);免疫细胞包括淋巴 细胞、 NK 细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞等。

常见的免疫细胞分离技术有:密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、磁珠分离 法等。

一、免疫细胞的分离和细胞活力的测定 –台盼兰拒染法

[目的]

1. 掌握免疫细胞的分离方法;
2. 掌握细胞活力测定的原理;
3. 掌握血细胞计数板的构造与使用;

[原理]

用台盼兰染料对小白鼠的脾脏细胞进行染色，死细胞由于细胞膜的破坏，染 料可以进入细胞内部，细胞被染成兰色，而活细胞由于细胞膜完整，染料不能进 入，在显微镜下呈一无色亮点。

[材料]

小白鼠、0.2%台盼兰染液、手术器械、血细胞计数板、显微镜等。

[方法]

1. 颈椎脱臼法处死小白鼠，取其脾脏和胸腺。
2. 将脾脏或胸腺放入适量(约 15 ml)生理盐水中，除去筋膜。
3. 取绿豆大小，用玻片研磨制成 10 ml细胞悬液。
4. 取1 ml细胞悬液于试管中，加入 1滴台盼蓝染液。
5. 混匀后静置3分钟，取10μl加入细胞计数板中，用低倍镜进行观察。

[实验结果]

镜下见蓝色的死细胞和无色的活细胞，计数 100个细胞后，算出细胞活力。 细胞活力=活细胞数/细胞总数×100%

[注意事项]

1. 脾脏去净筋膜，弃边缘，取其中间部分。
2. 研磨时不可用力过大，时间不宜过长。
3. 染色时间不宜过长或过短。
4. 血细胞计数板的使用方法(10 倍物镜、暗视野)。
5. 细胞计数原则:计上不计下，计左不计右，S 形随机计数。

[思考题]

简述主要的免疫细胞(T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞和 DC 细胞)的 表面标志和分离技术。

附:血细胞计数板的构造及用法

血细胞计数板由一厚玻璃制成，中央部分有两个低于水平面的计数室，在 显微镜下可看到被一“井”字分成了九个大方格，每格长度各 1mm(面积为 1mm2其)。中四个角的的四个大方格又分别被分成了十六个中方格，这是用来计数 白细胞 用的。中间的一个大方格首先用双线(三线)分为 25个中方格，每 个中方格又 用单线划分为 16个小方格，共计 400个小方格，为计数红细胞 用。如将盖玻片 置计数室上，盖玻片下计数室深度为 0.1mm，故每个大方格的 容积为 0.1mm3(μl)，即每个大方格的容积为 10^-4ml 。

参考资料

• 《医学免疫学》课件 新乡医学院 宋向凤、张国俊、徐春阳、孙爱平、孙书明、赵铁锁等老师