【2.4】illumina 二代测序原理及过程
一、Library Preparation 文库的构建
文库,就是 DNA 片段的一个集合。将测序片段打断之后就构成了一个 DNA 文库。简单来说就是把 DNA 分子用超声波打断成一定长度范围的小片段。目前除了一些特殊的需求之外,基本都是打断为 300bp-800bp 长的序列片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建出单链 DNA 文库,以备测序之用。
1.1 目的
文库需满足捕获 DNA/RNA、cluster、测序、数据分析的过程。
1.2 文库分类
- DNA 类文库:DNA 小片段文库、DNA 大片段文库、Exon 文库、PCR-Free 文库、简化基因组文库、单细胞样本文库等。
- DNA 小片段文库:片段大小在 1Kb 以下的普通 DNA 文库,可用来进行人重测序,动植物、微生物的 de novo 和重测序,16s rRNA 测序,宏基因组测序等项目类型的文库构建。
- RNA 类文库:转录组文库、表达谱 (RNA-Seq)、Small RNA。
详见:Illumina 平台测序原理及常见测序文库构建详细版。pptx
二、DNA 小片段建库流程
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1. 基因组 DNA 片段化:对 DNA 样品按需进行随机打断
- DNA 打断方法:机械打断、超声波打断,酶解法打断等。超声波打断可以设定打断的长度,常见的文库长度有 170bp 文库、350bp 文库、500、800、2k、5k、6k 甚至更长的 10K,20K 等,一般 1000bp 以下,称为小片段文库,否则是大片段文库。
- 注意,我们说 500bp 文库,这个 500 只是一个峰值。也就是里面大部分的片段在 500bp 附近,并不是每条片段都刚好是 500bp,可能有 300, 的,也可能有 800 的。在打断之后会有一个电泳的过程,将在一定范围内的回收。如果是 500bp 文库,可以回收 300-800bp 长度的片段。这个文库大小特别重要,也叫做插入片段长度 insert_size。在后面序列拼接,短序列比对的过程中会大量用到这个值。
2.末端补平
T4 DNA polymerase & DNA polymerase I (Klenow)。促进 DNA 向 5’→3’ 方向聚合;是 3’→5’外切核酸酶,有 3’→5’外切酶活性;无 5’→3’外切核酸酶活性。
3. 片段 3’端加 A 尾
用 Klenow 酶给 3’端加一个 A 碱基,在加了 A 碱基之后,原来的平末端就变成了粘性末端,这样更容易链接后面的引物和接头等。加完 A 碱基之后还需要加测序引物。
4.连接接头 Adapter
经过末端修饰的 PCR 片段的末端具有突出的 A 尾,而接头具有突出的 T 尾,可以使用 T4 DNA 连接酶将接头添加到 DNA 片段的两边,添加接头主要是为了后续 PCR 中作为引物扩增时可以继续添加 index 等修饰。
5.修饰接头
接头连接成功后,利用低循环扩增技术在接头处进行修饰,分别在两端添加 sequencing primer binding site1 / 2(测序引物结合位点)、index1/index2 以及我们称之 P5 和 P7 的寡核苷酸序列。
- index,也叫 Barcodes,是一个 6-8bp 的片段,对文库中的接头进行标记。因为一个 lane 可以同时测多个样品,为了避免混淆样品的 read products,每种样品的 DNA 由一种 index 修饰,这样测序得到的 reads 都是具有 index 标记的,在测序结果中,依据之前标签与样品的对应关系,就可以获得对应样品的数据。而这里的 index1 和 index2 是为了区分 paired-end 测序得到的双端 reads。
- P5 和 P7 是不同的,它们分别和 flowcell 上的接头互补和相同。
- index1 和 index2 也是不同的,与 P5 相连的是 index2,与 P7 相连的是 index1。
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6. 对 DNA 进行片段筛选
添加接头后的体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶,接头的添加也是过量的,而且也可能会有大片段的存在,所以需要用磁珠进行双筛来去除大片段以及各种杂质,从而获得成功添加接头的文库片段,双筛时要根据不同的文库片段来控制磁珠添加量,若添加了 PEG 等增强剂,则需要先进行纯化,再继续双筛。
7.PCR 扩增
加了接头的 DNA 片段,用与接头互补的引物来进行扩增。PCR 后需要再次进行磁珠纯化,将产物与杂质分离。
8.PCR 产物质检
用 Qubit DNA HS ASSAY KIT 对 PCR 产物进行定量;进行 2100 High SensitivityDNA Chip 电泳,判断片段大小是否符合后续测序要求(片段大小一般为 400bp 左右);通过 Qubit 定量结果和 2100 chip 检测出的片段大小计算摩尔浓度。
General Bar-coding Strategy
barcode/index 的选择有两个原则:碱基平衡和激光平衡。
- 碱基平衡是指的需要兼顾 barcode 序列的平衡度与复杂度,平衡度是指的碱基的比例是均衡的(1:1 是最均衡的。注意,是多个待测样品 barcode 之间的平衡,并非一个 barcode 内部的碱基平衡);而复杂度是指的碱基的种类是多样的(四种碱基同时存在是最多样的)。最好的 barcode 序列应该是同时有 A、T、G、C 四种碱基,且各碱基所占比例近似均为 25% 。
- 激光平衡就是尽量在使用的一组 barcode 中满足每个碱基位都是 A+C=G+T。
- 既不满足碱基平衡,又不满足激光平衡的 barcode 将会有很大的数据分离隐患,或者无法分离开样品,或者无法识别某些测序片段。
三、lllumina 桥式 PCR 扩增 —— Cluster generation 簇生成
- Flowcell(流动池)是有 2 个或 8 个 lane(泳道)的玻璃板,每个 lane 可以测一个样本或者多样本的混合物,且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一致的寡核苷酸(oligos,P7 和 P5 接头)。一个 lane 包含两列,每一列有 60 个 tile,每个 tile 会种下不同的 cluster,每个 tile 在一次循环中会拍照 4 次(每个碱基一次)。
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-
P5 和 flowcell 上的接头互补;P7 和 flowcell 上的接头相同。为了方便阐述,与 P5 互补的接头称为 P5’,与 P7 互补的接头称为 P7’。
-
与 P5 相连的是 index2,与 P7 相连的是 index1。
过程:
- Flowcell 上随机分布了两种不同的寡核苷酸接头,分别与 P5 互补(即 P5') , 与 P7 相同(即 P7)。待测 DNA 文库加入后,接头上的 P5 与 flowcell 上的 P5’接头杂交互补,以待测序列为模板进行互补链(即 reverse strand)的延伸,互补链的两端为 P5’和 P7’;
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- 加入的模板链没有固定在板子上,被切断并洗下,留下新延伸出的 reverse strand,reverse strand 的 P7’与 Flowcell 上的 P7 杂交互补,退火后会与附近的 p7 接头配对进行链的合成,即 桥式 PCR。合成的双链被解链,再分别与 Flowcell 上邻近的接头杂交互补,延伸,解链,杂交,延伸,解链。… 如此重复 35 个循环。此时扩增出的链都是固定在板子上的,呈指数扩增。最终形成以 reverse strand 为模板,在周围复制形成簇 cluster。
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- 桥式 PCR 完成后,使用 NaOH 将双链解链,并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶(Fpg)对 8-氧鸟嘌呤糖苷(8-oxo-G)的选择性切断作用,选择性地将 P5’与 reverse strand 的连接切断,只留下与 Flowcell 上 P7 连接的链,即 Forward strand,保证后续合成读取时的方向一致。同时游离的 3’端被阻断,防止不必要的 DNA 延伸。
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四、lllumina 测序
1. 加入测序引物(sequencing primer)、四种 dNTP、DNA 聚合酶。
测序引物结合到靠近 P5 的测序引物结合位点 1(sequencing primer binding site 1)上。在聚合酶的作用下,与 Forward strand 相应位置碱基配对的 dNTP 就会结合到新合成的链上,而由于叠氮基的存在,后面的 dNTP 无法继续连接。这时用水将剩余的 dNTP 和酶给冲掉,将 Flowcell 进行扫描,扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个 Flowcell 上有成千上万个 cluster 也在进行同样的反应,因此一个循环就能同时检测多个样本(这也是高通量的核心所在)。这个循环完成后,加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉,进行下一个循环(碱基的连接、检测与切除)。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出,也就是 Forward read 序列(Read1)。
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dNTP 有两个特点:
- 有荧光基团标记,每种碱基标记的荧光基团不一样;
- 3’末端连了一个叠氮基,这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连。
2. Index1 测序
如上图中,测序方向是从上往下读取的,那意味着一次只能读取一个方向。所有循环结束后,一个方向读完,用 Buffer 洗掉 read products。加入 index1 primer,与链上 index primer1 结合位点杂交配对,进行 index1 的合成及检测。Index1 测序完成后,洗脱测序产物,此时机器已通过荧光得到了 index1 的序列。
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3. Index2 测序
Forward strand 顶端的 P5 序列与 Flowcell 上的 P5’杂交配对,进行 index2 测序。测序完成后洗脱产物。
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4. Paired-end sequencing (即对 Reverse strand 测序)
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洗脱 index2 测序产物后,以 Flowcell 上的 P5’ 为引物,Forward strand 为模板进行桥式 PCR 扩增,得到双链。扩增后,NaOH 使双链变性为单链,并洗去已经测序完成的 Forward strand。然后,与前面类似,read primer2 结合到靠近 P7’的 read primer binding site 2 开始对 Reverse strand 的测序。测序完成后即可得到 Reverse read 序列(Read2)。
- illumina 的双末端测序:在打断的 DNA 片段两头正反方向各测两个片段,可以通过一定算法来进行序列组装,比对等一系列操作, 对于基因片段的重复、缺失和插入来讲,这种方法更加精确(具体算法参考相关文献),而且读长也更长,在基因组上的覆盖面更广。
- 在双链测序的过程中,如果正负链完全测通(例如测序仪读长为 150bp,待测的序列长度<= 150bp) 测序的末端可能包含 adapter 序列,需要利用软件将 adapter 去除。
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- illumina 的这种每次只添加一个 dNTP 的技术特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题,它的主要测序错误来源是碱基替换,目前它的测序错误率 1%-1.5% 左右。
参考资料
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